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一文看懂 | 如何用Annexin VPI法做細(xì)胞凋亡檢測

更新時(shí)間:2025-02-07點(diǎn)擊次數(shù):812

細(xì)胞凋亡過程常伴隨著明顯的細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化,比如細(xì)胞凋亡早期,質(zhì)膜內(nèi)側(cè)的磷脂酰絲氨酸會(huì)翻轉(zhuǎn)到細(xì)胞質(zhì)膜表面;而在凋亡的中后期,隨著細(xì)胞質(zhì)膜通透性的增大,一些較大分子的化合物,如碘化丙啶(PI),便可自由擴(kuò)散進(jìn)入細(xì)胞,將細(xì)胞核染上紅色熒光。

Annexin VPI檢測法原理

Annexin V是一種鈣依賴性磷脂結(jié)合蛋白,能與PS高親和力特異性結(jié)合。它不能透過完整的細(xì)胞膜,而早期凋亡細(xì)胞的細(xì)胞膜是完好的,對(duì)PI有拒染性。但在凋亡中晚期的細(xì)胞和死細(xì)胞,PI能透過細(xì)胞膜而使細(xì)胞核染上。因此Annexin V 和PI同時(shí)使用,可以將凋亡早期的細(xì)胞與其它細(xì)胞區(qū)別開來。

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Annexin VPI凋亡檢測推薦(李記生物)

[名稱]  流式凋亡檢測試劑盒

[貨號(hào)]  AC12L033

[規(guī)格]  100T

Annexin VPI檢測法操作步驟

? 對(duì)照管的設(shè)置

   1、空白管:誘導(dǎo)凋亡的細(xì)胞不加染料,用來調(diào)節(jié)電壓;

   2、單染管:分別需要只加PI和熒光標(biāo)記的Annexin V兩個(gè)單染管,用來調(diào)節(jié)補(bǔ)償;

   3、實(shí)驗(yàn)管:誘導(dǎo)凋亡的細(xì)胞加本次實(shí)驗(yàn)的所有熒光染料;

   4、陰性管:正常培養(yǎng)細(xì)胞加入染料,確認(rèn)細(xì)胞正常狀態(tài),排除假陽性。

? 懸浮細(xì)胞收集染色

   1、在進(jìn)行完細(xì)胞凋亡刺激后,離心5分鐘,棄上清,收集細(xì)胞,用PBS輕輕重懸細(xì)胞并計(jì)數(shù)。

   2、取1~5×10^5重懸的細(xì)胞,離心5分鐘,棄上清,加入500µl 結(jié)合液輕輕重懸細(xì)胞。

   3、加入5µl Annexin V-FITC,輕輕混勻;再加入5 μL 碘化丙啶,輕輕混勻。

   4、室溫避光孵育10分鐘??梢允褂娩X箔進(jìn)行避光。

   5、隨即進(jìn)行流式細(xì)胞儀檢測,Annexin V-FITC為綠色熒光,PI為紅色熒光。

? 貼壁細(xì)胞收集染色

   1、把細(xì)胞培養(yǎng)液吸出至一合適離心管內(nèi),PBS洗滌貼壁細(xì)胞一次,用胰酶細(xì)胞消化液(最好不用含有EDTA)消化細(xì)胞。

   2、細(xì)胞消化下來后,同理懸浮細(xì)胞的操作步驟。

? 上機(jī)檢測

      染色孵育后,立即進(jìn)行流式細(xì)胞儀檢測或熒光顯微鏡檢測。

Annexin VPI流式結(jié)果圖(僅做參考)

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圖:流式細(xì)胞儀凋亡檢測結(jié)果圖

 ? 左上象限(Annexin V-/PI+):為細(xì)胞碎片、機(jī)械損傷細(xì)胞或其它死細(xì)胞;Annexin V-/PI+象限中細(xì)胞數(shù)越多,實(shí)驗(yàn)結(jié)果可信度就越低,因盡量控制本象限細(xì)胞比例。

 ? 左下象限(Annexin V-/PI-):為正常的活細(xì)胞;

 ? 右上象限(Annexin V+/PI+):為晚期凋亡細(xì)胞或壞死細(xì)胞,細(xì)胞膜損傷的細(xì)胞DNA可被PI著染產(chǎn)生紅色熒光;

 ? 右下象限(Annexin V+/PI-):為早期凋亡細(xì)胞,在細(xì)胞凋亡的早期PI無法著染,不會(huì)產(chǎn)生紅色熒光信號(hào)。

Annexin VPI檢測法注意事項(xiàng)

 • 檢測貼壁細(xì)胞時(shí),若不好控制消化時(shí)間,建議用Accutase細(xì)胞消化液,對(duì)細(xì)胞損傷小且不會(huì)改變細(xì)胞膜上PS的分布。

 • 選擇Annexin-V的熒光染料時(shí)要考慮細(xì)胞的自發(fā)熒光,特別是培養(yǎng)時(shí)間久或藥物處理的細(xì)胞,一定注意細(xì)胞代謝物藥物本身的熒光,一般來說細(xì)胞代謝物的自發(fā)熒光會(huì)干擾FITC/PE,所以可建議用Annexin-V APC,藥物的干擾可查看藥物本身的發(fā)射光譜是否會(huì)對(duì)檢測選擇的染料有影響。

 • 細(xì)胞染色完成后,禁止固定,盡快檢測完,可將檢測管放冰上,可減少外界環(huán)境對(duì)檢測結(jié)果的影響。

 • 在做凋亡統(tǒng)計(jì)時(shí)一般指統(tǒng)計(jì)前凋亡,因?yàn)橹挥星暗蛲霾庞幸饬x,當(dāng)然也有文獻(xiàn)統(tǒng)計(jì)總的凋亡比例(前凋亡和晚期凋亡之和),單純的統(tǒng)計(jì)晚期凋亡比例意義不大。


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